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      94份玉米中6類真菌毒素檢測及污染情況

      發(fā)布時間: 2024-05-24  點(diǎn)擊次數(shù): 553次

      13C-T-2

      508.4

      198/229/322

      22/19/14

      121

      94份玉米中6類真菌毒素檢測及污染情況分析

      時間:2022/6/6閱讀:1016

      摘要:建立了玉米的一步法提取6類真菌毒素同時檢測的分析方法,共分析了96份玉米中6類真菌毒素的污染情況及地域分布情況,為監(jiān)測飼料質(zhì)量提供技術(shù)指導(dǎo)。稱取的樣品添加6類真菌毒素同位素內(nèi)標(biāo),以84%乙腈水和50%甲醇水作為提取試劑,以2mM乙酸銨0.1%甲酸水溶液和甲醇/乙腈和水為流動相梯度洗脫,采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測。94份玉米中6類真菌毒素的檢出率為98%,單種毒素檢出率最高的是伏馬毒素B1和B2,高達(dá)88%,嘔吐毒素和OTA檢出率極低,均未檢出。伏馬毒素B1和B2、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素的最高殘留量分別是89.1mg/kg、76.4ug/kg、3.95×103mg/kg和7.0mg/kg。地域分布上具有分布范圍廣,污染較嚴(yán)重的特點(diǎn)。建立的6類真菌毒素檢測方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確,結(jié)果分析對玉米中真菌毒素污染檢測和防控具有重要意義。

      關(guān)鍵詞:真菌毒素、液相色譜--串聯(lián)質(zhì)譜、污染情況、真菌毒素同位素內(nèi)標(biāo)

      真菌毒素屬于真菌的代謝產(chǎn)物,幾乎可以污染所有的農(nóng)作物,會損害動物體的肝臟、腎臟及皮膚組織等,進(jìn)而通過食物鏈的形式影響到人體的健康。[1]已知的真菌毒素多達(dá)300種以上,目前多個國家均建立了飼料中真菌毒素的*,[2-3]我國已于2017年推出國家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)GB 13078-2017飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn),并于2018年實施,其對黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、OTA、伏馬毒素B1和B2、T-2毒素等做出明確的檢測方法規(guī)定和*。本文采用94份玉米為樣本,對這6類真菌毒素進(jìn)行檢測方法開發(fā)和污染情況分析。為多毒素的快速檢測提供技術(shù)支持的同時,也為飼料中真菌毒素污染的監(jiān)測和防控提供幫助。本文采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜,通過加入同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正的手段,開發(fā)6類真菌毒素的檢測方法,并對94份玉米樣品進(jìn)行6類真菌毒素的檢測及污染情況分析。

      1 材料

      1.1儀器 TSQ Quantis液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、KS-7200DE超聲波提取儀和TGL-16M高速冷凍離心機(jī)

      1.2試劑 真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品:黃曲霉毒素B1(貨號:STD#1052)、嘔吐毒素(貨號:STD#3102)、玉米赤霉烯酮(貨號:STD#4012)、OTA(貨號:STD#5012)、伏馬毒素B1和B2(貨號:STD#2013)和T-2毒素(貨號:STD#3111)

      真菌毒素同位素內(nèi)標(biāo):黃曲霉毒素B1同位素內(nèi)標(biāo)(貨號:STD#1041U)、嘔吐毒素同位素內(nèi)標(biāo)(貨號:STD#3101U)、玉米赤霉烯酮同位素內(nèi)標(biāo)(貨號:STD#4010U)、OTA同位素內(nèi)標(biāo)(貨號:STD#5010U)、伏馬毒素B1同位素內(nèi)標(biāo)(貨號:STD#2030U)、伏馬毒素B2同位素內(nèi)標(biāo)(貨號:STD#2040U)和T-2毒素同位素內(nèi)標(biāo)(貨號:STD#3110U)

      1.3樣品  96份玉米種類及地域分布(樣品來源于全國近30個省份及地區(qū))

      96份玉米種類涉及青農(nóng)1801、鄭單958、萬盛189、登海W189、洛玉16、中選777等。依據(jù)我國區(qū)域劃分方式將94份玉米的分布區(qū)域進(jìn)行匯總統(tǒng)計

      區(qū)域

      省份

      份數(shù)

      華東地區(qū)

      山東、江蘇、安徽、浙江、福建、上海

      22

      華南地區(qū)

      廣東、廣西、海南

      10

      華中地區(qū)

      湖南、湖北、河南、江西

      12

      華北地區(qū)

      北京、天津、河北、山西、內(nèi)蒙古

      17

      西南地區(qū)

      四川、云南、西藏、重慶

      12

      西北地區(qū)

      寧夏、新疆、青海、陜西、甘肅

      10

      東北地區(qū)

      黑龍江、吉林、遼寧

      11

      2 方法

      2.1色譜及質(zhì)譜條件:

      色譜柱: Hypersil GOLD C18 (100*2.1 3um)

      流動相: 2mM乙酸銨0.1%甲酸水溶液和甲醇梯度洗脫伏馬毒素B1和B2、黃曲霉毒素B1、OTA和T-2毒素/乙腈水梯度洗脫嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮

      梯度表1

      時間

      流速mL/min

      2mM乙酸銨0.1%甲酸水

      甲醇

      0

      0.3

      70

      30

      1

      0.3

      70

      30

      3.5

      0.3

      30

      70

      4

      0.3

      30

      70

      5

      0.3

      5

      95

      9

      0.3

      5

      95

      10

      0.3

      70

      30

      梯度表2

      時間

      流速mL/min

      乙腈

      0

      0.3

      70

      30

      1

      0.3

      70

      30

      3.5

      0.3

      30

      70

      4

      0.3

      30

      70

      5

      0.3

      5

      95

      9

      0.3

      5

      95

      10

      0.3

      30

      70

      采用ESI離子源,分別用正離子模式掃描和負(fù)離子模式掃描,多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)采集數(shù)據(jù),6類真菌毒素及其對應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見下表:

      6類真菌毒素及其對應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

      毒素名稱

      母離子m/z

      子離子m/z

      碰撞電壓/V

      射頻透鏡

      電壓/V

      采集模式

      FB1

      722.3

      334/352

      40/36

      279

      [M+H]+

      13C-FB1

      756

      356/373/374/737

      39/34/35/26

      180

      [M+H]+

      FB2

      706.35

      318/336

      35/39

      243

      [M+H]+

      13C-FB2

      740.7

      340/358/376/723

      40/38/34/28

      216

      [M+H]+

      AFB1

      313.1

      241/269/285

      38/32/23

      176

      [M+H]+

      13C-AFB1

      330

      255/284/301

      39.7/32.8/24.1

      181

      [M+H]+

      OTA

      404.088

      193/221/239/241/358

      43/37/24/20/15

      143

      [M+H]+

      13C-OTA

      424

      250/377

      27/14

      140

      [M+H]+

      T-2

      484.21

      185/215/305

      22/19/13

      109

      [M+NH4]+

      毒素名稱

      母離子m/z

      子離子m/z

      碰撞電壓/V

      射頻透鏡電壓/V

      采集模式

      4]+

      DON

      295

      138/265

      17/12

      109

      [M-H]-

      13C-DON

      310

      145/279

      14/12

      109

      [M-H]-

      ZON

      317

      131/175/273

      30/24/19

      170

      [M-H]-

      13C-ZON

      335

      140/185/290

      31/25/19

      178

      [M-H]-

      注:FB1為伏馬毒素B1簡寫(下同),F(xiàn)B2為伏馬毒素B2簡寫,AFB1為黃曲霉毒素B1簡寫,OTA為赭曲霉A簡寫,T-2位T-2毒素簡寫,DON為嘔吐毒素簡寫,ZON為玉米赤霉烯酮簡寫;13C為其相應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)簡寫

      2.2標(biāo)準(zhǔn)品的配制

      2.2.1混合標(biāo)準(zhǔn)品配制:配制伏馬毒素B1和B2濃度為2.4ppm、黃曲霉毒素B1濃度為80ppb、玉米赤霉烯酮1.6ppm、嘔吐毒素3.2ppm、T-2毒素1.6ppm、OTA160ppb的混標(biāo)

      2.2.2同位素內(nèi)標(biāo)配制:配制伏馬毒素B1和B2濃度為240ppb、黃曲霉毒素B1濃度為8ppb、玉米赤霉烯酮160ppb、嘔吐毒素320ppb、T-2毒素160ppb、OTA16ppb的同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)品

      2.3樣品處理

      稱取5g樣品各兩份,加入同位素內(nèi)標(biāo)100uL,其中一份加入20mL84%乙腈水,另一份加入20mL50%甲醇水,超聲波震蕩提取20min,6000r/min離心5min,上清液過0.22um有機(jī)濾膜,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測。

      3.結(jié)果分析

      3.1譜圖

      FB1、FB2、AFB1、OTA和T-2的外標(biāo)及同位素內(nèi)標(biāo)的MRM圖

      DON和ZON的外標(biāo)及同位素內(nèi)標(biāo)的MRM圖

      3.2回收率

      項目

      FB1

      FB2

      AFB1

      ZON

      DON

      T-2

      OTA

      添加水平

      600ng/g

      600ng/g

      20ng/g

      400ng/g

      800ng/g

      400ng/g

      40ng/g

      回收率

      83.6%

      80.4%

      101.8%

      109.8%

      88.0%

      91.3%

      86.9%

      3.3線性

      項目

      相關(guān)系數(shù)

      線性范圍/ng

      線性方程

      FB1

      0.9991

      0.19-100

      y = 219.68x - 1206.9

      FB2

      0.9996

      0.19-100

      y = 911.45x - 1989.7

      AFB1

      0.9993

      0.049-40

      y = 61482x + 6.8125

      ZON

      0.9995

      0.094-35

      y = 8008.3x - 42517

      DON

      0.9999

      2-450

      y = 2755.5x - 796.14

      T-2

      0.9994

      0.1-100

      y = 110254x - 63112

      OTA

      0.9997

      0.01-20

      y = 1824.1x + 1.5954

      3.4整體污染情況

      96份玉米的6類真菌毒素檢測結(jié)果進(jìn)行分析匯總,所有樣品均未檢出赭曲霉毒素和T-2毒素。96份玉米中有2份玉米不含有這6類真菌毒素,10份玉米只含有1類真菌毒素,32份玉米含有2類真菌毒素,44份玉米含有3類真菌毒素,6份玉米含有4類真菌毒素。

      污染情況占比圖

      94份玉米中6類真菌毒素檢測及污染情況

      3.5區(qū)域分布情況

      依據(jù)94份樣品分布區(qū)域進(jìn)行劃分,對6種真菌毒素進(jìn)行分析匯總(匯總表見下),西北地區(qū)玉米受真菌毒素污染的種類最少,污染程度極低;華中地區(qū)、華北地區(qū)、西南地區(qū)和東北地區(qū)毒素污染情況較重;華東地區(qū)和華南地區(qū)玉米受真菌毒素污染的種類和程度最高。

      毒素種類

      華東

      華南

      華中

      華北

      西南

      西北

      東北

      總計

      0

      0

      0

      0

      0

      0

      2

      0

      2

      1

      2

      0

      0

      1

      1

      5

      1

      10

      2

      6

      2

      6

      7

      4

      1

      6

      32

      3

      13

      5

      6

      9

      5

      2

      4

      44

      4

      1

      3

      0

      0

      2

      0

      0

      6

      5

      0

      0

      0

      0

      0

      0

      0

      0

      6

      0

      0

      0

      0

      0

      0

      0

      0

      總計

      22

      10

      12

      17

      12

      10

      11

      94

      3.6超限情況

      3.6.1

      96份玉米的6類真菌毒素檢測結(jié)果進(jìn)行分析匯總,依據(jù)GB 13078-2017 飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)*進(jìn)行超限判斷(表1),超限樣品共計14份,其中9份樣品一類真菌毒素超限,剩余5份樣品兩類真菌毒素超限。針對赭曲霉毒素和T-2毒素含量,所有樣品均合格;此外,其余留的毒素超限情況如下:伏馬毒素B1+B2、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素的超限樣品份數(shù)分別為:3份、2份、11份和3份,其對應(yīng)的超限率分別為3.2%、2.1%、11.7%和3.2%。

      1 部分飼料原料中6類真菌毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)及*

      項目

      產(chǎn)品名稱

      檢測標(biāo)準(zhǔn)

      *

      黃曲霉毒素B1

      玉米加工產(chǎn)品、花生餅

      NY/T 2071

      ≤50ug/kg

      OTA

      谷物及其加工產(chǎn)品

      GB/T 30957

      ≤100ug/kg

      玉米赤霉烯酮

      玉米及其加工產(chǎn)品

      NY/T 2071

      ≤0.5mg/kg

      嘔吐毒素

      植物性飼料原料

      GB/T 30956

      ≤5mg/kg

      T-2毒素

      植物性飼料原料

      NY/T 2071

      ≤0.5mg/kg

      伏馬毒素B1+2

      玉米及其加工產(chǎn)品

      NY/T 1970

      ≤60mg/kg

      3.6.2

      96份玉米的6類真菌毒素檢測結(jié)果進(jìn)行分析匯總,依據(jù)GB 2761-2017 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素*進(jìn)行超限判斷(表2),超限樣品共計46份,其中25份樣品一類真菌毒素超限,剩余21份樣品兩類真菌毒素超限。針對赭曲霉毒素含量,所有樣品均合格;此外,其余留的毒素超限情況如下:黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素的超限樣品份數(shù)分別為:4份、35份和28份,其對應(yīng)的超限率分別為4.3%、37.2%和29.8%。

      2 部分食品中6類真菌毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)及*

      項目

      食品類別

      檢驗方法

      *

      黃曲霉毒素B1

      玉米、玉米面及玉米制品

      GB 5009.22

      20ug/kg

      OTA

      谷物及其制品

      GB 5009.96

      5.0ug/kg

      玉米赤霉烯酮

      玉米、玉米面(渣、片)

      GB 5009.209

      60ug/kg

      嘔吐毒素

      玉米、玉米面(渣、片)

      GB 5009.111

      1000ug/kg

      3.7 單類毒素分析

      由于所有樣品均未檢出赭曲霉毒素和T-2毒素,故只對其余四類真菌毒素進(jìn)行單獨(dú)分析94份玉米中6類毒素污染情況對比圖

      94份玉米中6類真菌毒素檢測及污染情況

      3.7.1 伏馬毒素B1+B2

      96份玉米的伏馬毒素B1和B2檢測結(jié)果進(jìn)行分析匯總,有檢出樣品數(shù)量為88份,占比93.6%,檢測結(jié)果在0.0503mg/kg-89.1mg/kg,中位值為6.41mg/kg;整體污染水平為10.9mg/kg,陽性污染水平為11.6mg/kg。

      3.7.2 黃曲霉毒素B1

      96份玉米的黃曲霉毒素B1檢測結(jié)果進(jìn)行分析匯總,有檢出樣品數(shù)量為29份,占比30.9%,檢測結(jié)果在2.20ug/kg-76.4ug/kg,中位值為4.58ug/kg;整體污染水平為3.48ug/kg,陽性污染水平為11.3ug/kg。

      3.7.3 玉米赤霉烯酮

      96份玉米的玉米赤霉烯酮檢測結(jié)果進(jìn)行分析匯總,有檢出樣品數(shù)量為56份,占比59.6%,檢測結(jié)果在10.6mg/kg-3.95×103mg/kg,中位值為98.3mg/kg;整體污染水平為329mg/kg,陽性污染水平為552mg/kg。

      3.7.4 嘔吐毒素

      96份玉米的嘔吐毒素檢測結(jié)果進(jìn)行分析匯總,有檢出樣品數(shù)量為56份,占比59.6%,檢測結(jié)果在0.1mg/kg-7.0mg/kg,中位值為1.0mg/kg;整體污染水平為0.8mg/kg,陽性污染水平為1.4mg/kg。

      4討論

      目前,從技術(shù)角度講,飼料中真菌毒素檢測共涉及到6大類,檢測標(biāo)準(zhǔn)4項,前處理方法不一,凈化產(chǎn)品各異,對人員、操作、設(shè)備要求苛刻,給檢測帶來嚴(yán)峻的挑戰(zhàn);從污染根源分析,一種真菌可能產(chǎn)生多種毒素,一種原料會受到多種真菌感染,往往是單個飼料樣品需要檢測多種真菌毒素;從現(xiàn)實情況來看,飼料受真菌毒素污染情況較嚴(yán)重,且分布不均勻,需要加強(qiáng)其毒素監(jiān)測。本文所述的一步法檢測,采用直提的方式,同位素校正的手段,在保證結(jié)果準(zhǔn)確的前提下,很大程度上降低操作難度,縮短檢測周期,同時也控制了實驗成本。

      綜上,本文不僅為飼料中6類真菌毒素的檢測提供有效的方法支撐,同時也為飼料中真菌毒素殘留的檢測方向提供指導(dǎo),為保證飼料產(chǎn)品的質(zhì)量提供幫助。

      [1]王艷霞 飼料及原料中真菌毒素的危害、降解和檢測技術(shù)研究[J].飼料研究,NO.08 2022:158.

      [2]孫梅峰,豆小文,張磊,等.真菌毒素毒性及其在生物樣本中檢測技術(shù)研 究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2020,34(10):788-800.

      [3]張徽,孫金旺,劉媛,等.農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素污染生物控制關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新與 綜述 NO.08 2022 160 飼料研究 FEED RESEARCH 應(yīng)用[J].中國科技成果,2020(3):69-70




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