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      普瑞邦飼料中伏馬毒素HPLC檢測的解決方案

      發(fā)布時間: 2019-03-29  點擊次數(shù): 1047次

      伏馬毒素起因和特性

      伏馬毒素主要是由串珠鐮刀菌菌f.moniliforme和f.proliferatum在一定溫度和濕度條件下繁殖所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。直到1988年,南非和美國的研究人員才從霉變的玉米中分離出伏馬毒素(fumonisins)b1。到目前為止,發(fā)現(xiàn)的伏馬菌素有FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4和FP1共11種。糧食在加工、貯存、運輸過程中易受上述兩種真菌污染,特別是當(dāng)溫度適宜時,更利于其生長繁殖,從而產(chǎn)生出一類結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似的毒素,其中FB1是其主要組分占60%以上,其毒性也大。因此,伏馬毒素可以通過糧食加工、飼料生產(chǎn)等過程對畜牧業(yè)乃至人類健康產(chǎn)生較嚴重的危害。

      伏馬毒素純品為白色針狀結(jié)晶,為一類相關(guān)的極性、水溶性代謝產(chǎn)物,為多氫醇和丙三羧酸的雙酯化合物,對熱很穩(wěn)定,不易被蒸煮破壞,在多數(shù)糧食加工處理過程均比較穩(wěn)定。

      食品污染狀況

      FB1對食品污染的情況在世界范圍內(nèi)普遍存在,主要污染玉米及玉米制品,其污染的飼料主要為以玉米為原料的飼料。FB1為水溶性霉菌毒素,對熱穩(wěn)定,不易被蒸煮破壞,所以同AFT(黃曲霉毒素)一樣,控制農(nóng)作物在生長、收獲和儲存過程中的霉菌污染仍然是至關(guān)重要。

      伏馬菌素對玉米的污染率和污染水平受國家和地區(qū)、玉米品種、季節(jié)的影響。1995年~1996年,Amra等對從埃及不同省份收集的120份樣品進行了檢測,結(jié)果顯示,冬季收集的白玉米和黃玉米FB1污染率均為高。伏馬菌素還可以污染其他糧食及其制品,且不同地區(qū)污染狀況也存在差異。

      1996年我國對玉米、小麥等糧食作物中FB1污染進行調(diào)查。發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)均有不同程度污染。我國食道癌高發(fā)區(qū)林縣的玉米伏馬菌素污染率為48%。因此,人們懷疑該地區(qū)食道癌高發(fā)與食用污染此毒素玉米相關(guān)。該毒素已被世界衛(wèi)生組織列為近年來首先進行研究的幾種霉菌毒素之一。

      伏馬毒素的危害

      1.馬大腦白質(zhì)軟化癥              
        這是一種馬的神經(jīng)失調(diào)疾病。根據(jù)1988年南非研究人員的試驗結(jié)果,每天以0.125mgkg體重的水平給馬進行皮下注射,大約7天后馬開始發(fā)瘋、發(fā)狂,沖撞欄桿而死。解剖發(fā)現(xiàn)馬的大腦呈現(xiàn)白質(zhì)軟化癥狀。1989年,玉米中的伏馬毒素給美國有很多州的農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)造成了巨大的損失。               
        2.豬肺水腫             
        1992年和1994年美國和南非的科學(xué)家研究表明,每天伏馬毒素的攝取量在0.4mgkg體重以上均可引發(fā)豬的肺水腫,還可造成豬生殖系統(tǒng)的紊亂,如早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎和發(fā)情周期異常等。這種病在美國及其他國家都有發(fā)現(xiàn)。
        3.小鼠肝癌              
        1991年南非科研人員對小鼠進行了伏馬毒素的毒理試驗,試驗結(jié)果表明伏馬毒素引發(fā)肝癌。1998年又對大鼠進行了伏馬毒素毒理試驗,獲得相同的結(jié)果。                
        4.人類食道癌              
        早在1988年南非科學(xué)家就對食道癌發(fā)病率高和低的地區(qū)進行過調(diào)查,食道癌發(fā)病率與主食玉米受伏馬毒素污染呈正相關(guān),進一步的動物試驗也得到了相同的結(jié)果。1994年中國學(xué)者和日本學(xué)者對食道癌高發(fā)區(qū)的河南省林縣進行了一次調(diào)查,發(fā)現(xiàn)該地區(qū)主食玉米中伏馬毒素水平高達30~50mgkg,發(fā)霉玉米中伏馬毒素高值達118.4mgkg。目前伏馬毒素引發(fā)食道癌的機理還不清楚,需進一步確證和研究。 

      各國對伏馬毒素的*

      2001年美國食品與藥物管理局(FDA)發(fā)布了供人類食用的玉米和玉米產(chǎn)品伏馬毒素高*指導(dǎo)性公告,規(guī)定人類食用玉米中伏馬毒素高*為2mgkg;同時,FDA的畜牧醫(yī)學(xué)中心(CVM)也發(fā)布了動物飼料中伏馬毒素的高*指導(dǎo)性公告,規(guī)定其*范圍為1~50mgkg。


                    表2  FDA對伏馬毒素在動物飼料中的推薦*(20006月)

       

       玉米及其副產(chǎn)品用于下列動物飼料

       推薦*(FB1+FB2+FB3,mg/kg

       馬和兔

       5ppm(不超過日食量的20%)*

       豬和鯰魚

       20ppm(不超過日食量的20%)*

       產(chǎn)子的反芻動物、家禽、貂

       30ppm(不超過日食量的20%)*

       大于3月用于屠宰的反芻動物、用于制作裘皮的貂

       60ppm(不超過日食量的20%)*

       用于屠宰的家禽

       100ppm(不超過日食量的20%)*

       其他各種牲口和寵物

       10ppm(不超過日食量的20%)*

       *以干基作為計算基準

      伏馬毒素的檢測

      伏馬毒素的檢測先后使用過薄層色譜法、氣相色譜法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、液相色譜法(HPLC)等,目前研究和應(yīng)用得多的是利用免疫親和柱凈化后的熒光儀檢測法和HPLC法。

      普瑞邦伏馬毒素檢測方案介紹

      (一)   免疫親和柱-液相色譜法:符合GBT 25228-2010 糧油檢驗 玉米及其制品中伏馬毒素含量測定 免疫親和柱凈化液相色譜法

      Pribolab®(普瑞邦)應(yīng)用免疫親和柱凈化,利用液相色譜儀和熒光檢測器檢測可提供伏馬毒素測定的HPLC檢測方案,得出的結(jié)果準確可靠,檢出限好,是一種很好的檢測伏馬毒素的方法,僅供廣大用戶參考。

      1.   設(shè)備和耗材配置  

       

      序號

      品名

      規(guī)格及參數(shù)

      數(shù)量

      用途

      1

      液相色譜儀

       

      一臺

      分析檢測

      2

      熒光檢測器

       

      一臺

      讀取熒光信號

      3

      Pribolab真菌毒素色譜柱

      150/250mm

      貨號:PRC-18

      一支

      配套各類色譜儀,霉菌毒素檢測用

      4

      PriboFast®伏馬毒素免疫親和柱

      3ml25/盒,

      貨號:IAC-050-3

      若干

      高特異性,純化樣本

      5

      高速均質(zhì)器

      達到22000rpm 以上,貨號:EQ-WR-1L

      一臺

      耐腐蝕,高速,均質(zhì)

      6

      PriboFast®玻璃纖維濾紙

      100P,110mm1.5μm

      貨號:GMF-110

      一盒

      霉菌毒素過濾

      7

      PriboFast®八位泵流操作架

      貨號:EQ-PUMP-8

      一臺

      用于控制免疫親和柱過柱流速

      8

      伏馬毒素標準品

      50µg/ml伏馬毒素B1, 50µg/ml伏馬毒素B2溶于乙腈/水(50/50),

      貨號:STD#2011

      1ml

      用于定量分析標準品的配制

      2. 樣品前處理:普瑞邦為飼料提供不同的處理方案(詳細方案請聯(lián)系普瑞邦,普瑞邦開發(fā)了針對多種飼料基質(zhì)提供優(yōu)化的處理方案)

      樣品處理:

      花生,玉米,大米,小麥及其制品和飼料

      ----50 g 研磨的樣品 + 5g鹽置于均質(zhì)杯中。

      ----加入100mL 甲醇:水(8020)溶液。

      ----蓋上杯蓋,高速均質(zhì)5分鐘。

      ----4000r/min離心5min或用槽紋濾紙過濾;

      ----取10mL濾液并加入40mL PBS溶液將濾液稀釋,混勻。玻璃微纖維濾紙過濾,取稀釋后液體待測;

      ----將上步稀釋液通過微纖維濾紙過濾,濾液收集于玻璃注射器筒中,量取10mL。

      3. 免疫親和柱凈化:

      操作程序:符合GB/T 25228-2010國標方法

      ----將免疫親和柱連接于泵流操作架的10mL注射器下。準確移取10mL樣品提取液注入注射器;

      ----富集:空氣壓力泵與注射器連接,調(diào)節(jié)壓力使提取液以約2-3mL/min(1滴/3秒)流速緩慢通過免疫親和柱,直至2-3mL空氣通過柱體;

      ----洗滌: 用10mL 0.1%的吐溫/PBS清洗,再以10mL水淋洗柱子2次,棄去全部流出液,并使2-3mL空氣通過柱體;

      ----洗脫可采取以下方式之一進行優(yōu)選2

      ----洗脫1: 準確加入1.0mL色譜級甲醇洗脫,孵育30秒以上(孵育即甲醇在柱子中浸泡),然后以流速為1-2mL/min過柱,收集全部洗脫液供檢測用。

      ----洗脫2: 為保證洗脫充分,建議以1.5mL色譜甲醇分兩步進行洗脫,流速為1-2mL/min(1滴/秒,重力即可) 。首先,加入0.5ml甲醇洗脫,重力過柱,當(dāng)溶劑通過柱子后,等待30秒后再加入1ml甲醇進行洗脫,過柱前孵育30秒以上(孵育即甲醇在柱子中浸泡)。收集全部甲醇洗脫液供衍生化反應(yīng)用。

      4. 衍生化反應(yīng)

      分別取凈化后的樣本液和標準工作溶液各50ul,分別置于1ml的各個試管中,各加入50ul OPA衍生液,渦流混合器上混合30s,靜置3min后,立即取20ul衍生液進液相色譜儀分析。

      5. 液相色譜分析

      HPLC-色譜柱 :C-18色譜柱   150 x 4.6 mm;
      流  動  相 :甲醇-0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液  77:23
      流  速  : 1 mL/min                         
      柱  溫  : 室溫
      進 樣 體 積 : 20μL
      熒光檢測器:λ-激發(fā)波長:335nm λ-發(fā)射波長:440 nm
      HPLC配置:液相色譜儀帶有熒光檢測器

      溫馨TIPS

      1. 谷物、飼料中真菌生長繁殖的有利條件主要是適宜的溫度與水分。如能將谷物、飼料等貯存于10℃以下,水分保持在10%以下,就能有效地防霉。

      2. 從事真菌毒素科研及檢測的人員,必須注意防護,如穿戴隔離衣帽,在進行真菌分離培養(yǎng)工作時,應(yīng)戴口罩,并盡量防止孢子飛揚。

      3. 操作臺面如有漏濺,應(yīng)立即用新配的5%次氯酸鈉消毒。以5%次氯酸鈉(NaOCl)處理時,黃曲霉毒素于數(shù)秒鐘內(nèi)即被破壞,故是常用的消毒劑。

      4. 也有應(yīng)用生物學(xué)方法解毒的報道,生物學(xué)方法成本低,收效大,可能是一種有前途的除毒措施。

      鑒于霉菌毒素對人體的危害,提醒各位奮斗在抗毒一線的老師們一定要注意保護自身安全哦! 

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