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      中藥材黃曲霉毒素檢測技術(shù)概述

      發(fā)布時間: 2019-03-28  點擊次數(shù): 1567次

      一、 中藥材質(zhì)量安全現(xiàn)狀

       

      中藥材是中醫(yī)防病治病的重要基礎(chǔ)。中藥材在田間生長、采收加工、儲藏運輸?shù)雀鱾€環(huán)節(jié)都會因污染霉菌而發(fā)生霉變。這些霉菌分泌的有毒代謝產(chǎn)物使中藥材發(fā)霉變質(zhì),直接威脅到群眾的用藥安全。中藥中的霉菌毒素主要有AFT ,赭曲霉素,玉米赤霉烯酮,展青毒素,伏馬毒素等。中藥材的種類是影響真菌毒素污染的主要因素,易污染的中藥材,在不同的溫、濕度條件下均可產(chǎn)生真菌毒素。溫度和濕度條件也可以影響真菌毒素的增長,如:AFT 在不同的溫、濕度條件下均可以產(chǎn)生;赭曲霉毒素需要在濕度較高的條件下才能產(chǎn)生。

       

      近年來,隨著中藥材在市場上的持續(xù)升溫,其安全性越來越引起人們的關(guān)注。真菌毒素殘留作為中藥材微量外源性有毒有害物質(zhì),一般不表現(xiàn)出急性毒性,但通常有較強的蓄積性,致癌、致畸、致突變作用明顯,嚴重影響中藥材的安全性。

       

      二、 中藥材真菌毒素控制相關(guān)國家法規(guī)

       

      近年來,各級食品藥品監(jiān)管部門不斷加大中藥監(jiān)管力度,努力保持中藥質(zhì)量總體穩(wěn)定。

       

      國家食品藥品監(jiān)督管理局關(guān)于規(guī)范中藥生產(chǎn)經(jīng)營秩序嚴厲查處違法違規(guī)行為的通知(國食藥監(jiān)安[2012]187號文件)中,要求加強對AFT 、重金屬及有害元素、農(nóng)藥殘留量等安全性指標的檢測和控制,切實保證中藥材質(zhì)量和安全,另要求企業(yè)具備與生產(chǎn)品種相適應(yīng)的檢驗設(shè)備和能力,嚴把質(zhì)量檢驗關(guān)。

       

      《國家藥品安全“十二五”規(guī)劃》,規(guī)劃中明確指出“開展藥品快速檢驗技術(shù)研究,搭建檢驗技術(shù)共享平臺”、“加快推進藥品快速檢驗技術(shù)在基層的應(yīng)用,配置快速檢驗設(shè)備”,“加強縣級機構(gòu)快速檢驗能力建設(shè)”的要求。

       

      三、 中藥材真菌毒素檢測項目及*

       

      國家食品藥品監(jiān)督管理局對柏子仁、蓮子、使君子、檳榔、麥芽、肉豆蔻、決明子、遠志、薏苡仁、大棗、地龍、蜈蚣、水蛭、全蝎等14味藥材及其飲片品種項下增加“AFT ”檢查項目,限度為“AFT B1不得過5 μg/kg;AFT G2、AFT G1、AFT B2總量不得過10 μg/kg”。

       

      2010 版《藥典》附錄IX V AFT 測定采用液相色譜法,另外增補藥典描述該法檢測建立增加柱后光化學衍生法。

       

      四、 中藥材AFT 檢測方案介紹

      (一)   儀器分析法

      特點

      優(yōu)點

      缺點

      準確、靈敏、抗干擾性強,國家檢測部門的確證方法。

      儀器成本高、對操作人員技術(shù)要求高、操作復雜、耗時較長。

      免疫親和柱-液相色譜法:符合2010版《藥典》附錄IX V中AFT 測定液相色譜法,另外增補藥典描述該法檢測建立增加柱后光化學衍生法。

      1.   設(shè)備和耗材配置  

      序號

      品名

      規(guī)格及參數(shù)

      數(shù)量

      用途

      1

      液相色譜儀

       

      一臺

      分析檢測

      2

      熒光檢測器

       

      一臺

      讀取熒光信號

      3

      Pribolab真菌毒素色譜柱

      150/250mm

      貨號:PRC-18

      一支

      配套各類色譜儀,霉菌毒素檢測用

      4

      PriboFast®AFT 總量免疫親和柱

      3ml,25支/盒,快速過柱型,

      貨號:IAC-011-3

      若干

      高特異性,純化樣本

      5

      PriboFast®KRC光化學柱后衍生反應(yīng)裝置

      貨號:EQ-KRC

      一臺

      適用于AFT 檢測

      6

      高速均質(zhì)器

      達到22000rpm 以上,貨號:EQ-WR-1L

      一臺

      耐腐蝕,高速,均質(zhì)

      7

      PriboFast®玻璃纖維濾紙

      100P,110mm,1.5μm

      貨號:GMF-110

      一盒

      霉菌毒素過濾

      8

      PriboFast®八位泵流操作架

      貨號:EQ-PUMP-8

      一臺

      用于控制免疫親和柱過柱流速

      9

      AFT 混標

      2µg/mlAFT B1, G1;0.5µg/mlAFT B2;G2 (4/1/4/1)溶于乙腈,

      貨號:STD#1081

      1ml

      用于定量分析標準品的配制

      2. 樣品前處理:普瑞邦為中藥材提供不同的處理方案(詳細方案請聯(lián)系普瑞邦,普瑞邦開發(fā)了針對多種中藥材基質(zhì)提供優(yōu)化的處理方案)

      3. 免疫親和柱凈化:

      富集--洗滌--洗脫--收集全部洗脫液供化學衍生檢測用。

      4. 化學衍生

      為什么使用光化學衍生器? 由于黃曲霉具有較強的紫外吸收和產(chǎn)生熒光的特性,因此可以進行HPLC-紫外或熒光檢測,但是同時AFT 中的B1、G1 由于其在含水的流動相中容易產(chǎn)生熒光淬滅,因此在很多的實驗中都會采用衍生法測定AFT 。衍生的方法也很多:有柱前的,柱后的,在線的,由于在線的柱后光化學衍生有明顯的優(yōu)勢,所以現(xiàn)在被增補為藥典的檢測方法,優(yōu)勢主要在于無需任何化學試劑、對人員無傷害;無需人員直接操作、避免誤差; 無需擔心衍生液腐蝕檢測器。

      5. 液相色譜分析

       

       

      PriboFast KRC光化學衍生器  波長:254 nm
      HPLC-色譜柱 :AFT C-18色譜柱   150 x 4.6 mm;
      流  動  相 :甲醇-水  45:55
      流  速  : 1.0 mL/min                         

      柱  溫  : 35 °C
      進 樣 體 積 : 20μL
      熒光檢測器:λ-激發(fā)波長:365nm λ-發(fā)射波長:455 nm

      HPLC配置;液相色譜儀帶有熒光檢測器;AFT 色譜柱 C18 150 x 4.6 mm

      (二)酶聯(lián)免疫法

      特點

      優(yōu)點

      缺點

      靈敏度高、耗時較短、樣本處理比較簡單、對技術(shù)人員要求不高、檢測成本低、可同時檢測大批量樣本。適用于大量樣本快速定量篩查。

      可能存在一定假陽性率(交叉反應(yīng)率)。       

      Pribolab(普瑞邦)推出的PriboFastRAFT 總量試劑盒具有較高的靈敏度和準確度,適用于大量樣本的定量分析。

      1. 方法原理

      采用直接競爭酶聯(lián)免疫法,在微孔板上預包被AFT 抗原,加入樣本(或AFT 標準品溶液)及辣根過氧化物酶標記的AFT 特異抗體。樣本或標準品溶液中的抗原與預包被在板孔上的抗原競爭結(jié)合酶標抗體。未結(jié)合的酶標抗體在洗滌時被除去。再加入TMB顯色液,讀取吸光值。樣品吸光值與其所含AFT 總量成負相關(guān),與標準曲線比較即可得出樣品中AFT 總量的含量。

      2. 設(shè)備和試劑配置:

      序號

      品名

      規(guī)格及參數(shù)

      數(shù)量

      用途

      1

      PriboFastRAFT 總量試劑盒

      96T,靈敏度:0.1ppb

      貨號:EKT-011

      一盒

      定量分析檢測

      2

      PriboSpin離心小柱

      25T

      一盒

      凈化樣本

      3

      酶標儀(酶聯(lián)免疫檢測儀)

      濾光片:450nm

      一臺

      配套各類色譜儀,霉菌毒素檢測用

      3. 樣本前處理:中藥材:粉碎、提取、離心,取上清液加入PriboSpin離心小柱進行凈化。

      為什么要用PriboSpin離心小柱?中藥材的基質(zhì)復雜,提取時樣本液顏色較深,而且不容易去除。有機試劑提取凈化方法繁瑣,試劑揮發(fā)對環(huán)境及人體造成危害,且凈化效果不穩(wěn)定。用PriboSpin離心小柱,則只需提取液離心過柱,即可去除提取液中的雜質(zhì),方便快捷,凈化效果好,且回收率可以達到85%以上。

      4. 檢測步驟

      4.1 免疫反應(yīng)30min;洗板5次;顯色反應(yīng)30min;終止反應(yīng),酶標儀讀OD值。

      5. 分析結(jié)果的表述

      用酶標儀判讀結(jié)果。

       

      (三)免疫金標快速檢測法

      特點

      優(yōu)點

      缺點

      操作簡單、費用低廉、耗時短、檢測快速。適用于樣本快速定性初步篩查

      存在一定假陽性、數(shù)據(jù)不方便保存及分析。

      Pribolab(普瑞邦)推出的PriboStripTMAFT 總量免疫金標快速檢測條特異性好,適用于檢測樣本量大;短時間出具檢測結(jié)果并控制經(jīng)費的情況,可以快速定性,初篩。

      1. 方法原理

      AFT 總量快速檢測條應(yīng)用了競爭抑制免疫層析的原理,樣本中的AFT 總量在酶標孔中與膠體金標記的特異性抗AFT 單克隆抗體結(jié)合,抑制了抗體和NC膜檢測線上AF-BSA偶聯(lián)物的結(jié)合。如果樣本中AFT 總含量大于0.5 ug/L,檢測線不顯顏色,結(jié)果為陽性;反之,檢測線顯紅色,結(jié)果為陰性。

      2.   設(shè)備和試劑配置

      序號

      品名

      規(guī)格及參數(shù)

      數(shù)量

      用途

      1

      PriboStripTMAFT 總量免疫金標快速檢測條

      25T

      檢測限:10ppb

      貨號:PR-011

      一盒

      定性分析檢測

      3.   分析步驟:中藥材粉碎溶解后取上清液檢測。吸取樣品滴加到加樣孔中,8-15分鐘讀取結(jié)果。在C線顯色的情況下:T 線顯色比C線深或一樣深是陰性。T 線顯色比C線淺,或無顯色是陽性結(jié)果。

       

      五、 溫馨TIPS:

      1. 中藥中真菌生長繁殖的有利條件主要是適宜的溫度與水分。如能將中藥貯存于10℃以下,水分保持在10%以下,就能有效地防霉。

      2. 從事真菌毒素科研及檢測的人員,必須注意防護,如穿戴隔離衣帽,在進行真菌分離培養(yǎng)工作時,應(yīng)戴口罩,并盡量防止孢子飛揚。

      3. 操作臺面如有漏濺,應(yīng)立即用新配的5%次氯酸鈉消毒。以5%次氯酸鈉(NaOCl)處理時,AFT 于數(shù)秒鐘內(nèi)即被破壞,故是常用的消毒劑。

      4. 也有應(yīng)用生物學方法解毒的報道,生物學方法成本低,收效大,可能是一種有前途的除毒措施。

      鑒于霉菌毒素對人體的危害,提醒各位奮斗在抗毒一線的老師們一定要注意保護自身安全哦!

       

      關(guān)于Pribolab®(普瑞邦)

      Pribolab®(普瑞邦)是面向提供霉菌毒素檢測解決方案的主要服務(wù)商之一,憑借強大的研發(fā)團隊和專業(yè)的霉菌毒素檢測技術(shù)的研究,為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品加工與糧食、飼料工業(yè)等行業(yè)提供專業(yè)的霉菌毒素檢測技術(shù)與產(chǎn)品服務(wù),同時為社會提供食品、飼料及飲料等的霉菌毒素、食品成分等檢測分析。

      • 聯(lián)系電話電話400-6885349
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