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      液相色譜法檢測牛奶,奶粉等產(chǎn)品中黃曲霉毒素M1操作規(guī)程

      發(fā)布時間: 2019-03-27  點(diǎn)擊次數(shù): 1663次

      1. 儀器

      液相色譜儀配熒光檢測器,震蕩器(或高速攪拌器),高速離心機(jī)

       

      2. 試劑與試液

      色譜甲醇,蒸餾水,乙腈+水(25+75),石油醚,2.5 10%乙腈, 氫氧化鈉溶液(0.5mol/L),玻璃纖維濾紙(PriboFast免疫親和柱免費(fèi)贈送)

       

      3. 測定法

      本法系用液相色譜法(GB/T 18980-2003)測定牛奶,奶粉等產(chǎn)品中的黃曲霉毒素M1,除另有規(guī)定外,按下列方法測定。

      3.1 色譜條件

      色譜柱:C18柱,150×4.6mm,5um

      檢測器:熒光檢測器;激發(fā)波長365nm,發(fā)射波長435nm;

      流動相:乙腈-水(25:75)

      流  速:1.0ml/min

      進(jìn)樣量:20ul

      柱  溫:室溫

      3.2  標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

      取黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈稀釋成0.5ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。根據(jù)使用需要,準(zhǔn)確吸取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液,置5ml的容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,配成相當(dāng)于1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液,即得。

      3.3  樣品前處理

      3.3.1牛奶

      將100mL牛奶水浴加熱至40℃;

      4000r/min離心15min,收集50mL清澈液待用;

      3.3.2乳粉和粉狀嬰幼兒配方食品

      稱取10g奶粉樣品,將100mL50℃水多次少量加入,攪拌,使奶粉充分溶解;

      6000r/min離心15min,收集50mL清澈液待用;

      3.3.3發(fā)酵乳(包括固體狀、半固體狀和帶果肉型)

      稱取60 g混勻的試樣,用0.5 mol/L 的氫氧化鈉溶液在酸度計(jì)指示下調(diào)pH至7.4;

      用高速均質(zhì)器在 9500 轉(zhuǎn)/分鐘,高速勻漿5 min

      水浴加熱至40℃;

      4000r/min離心15min,收集50mL清澈液待用

      3.3.4干酪

      稱取經(jīng)切細(xì)、過10目圓孔篩混勻的試樣5g置于50 mL離心管中,加2 mL水和30 mL甲醇;

      用高速均質(zhì)器在 9500r/分鐘,高速勻漿5 min;

      超聲提取30 min;

      在6000r/分鐘下離心15 min,收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。

      在分液漏斗中加入30 mL石油醚,振搖2 min;

      待分層后,將下層移于50 mL燒杯中,棄去石油醚層。

      重復(fù)用石油醚提取2次;。

      將下層溶液移到100 mL圓底燒瓶中,減壓濃縮至約2 mL;

      濃縮液倒入離心管中,燒瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗滌,洗滌液一并倒入50 mL離心管中;

      加水稀釋至約50 mL,在6000 轉(zhuǎn)/分鐘下離心 5 min,上清液供凈化處理。

      3.3.5奶油

      稱取5g試樣,置于50 mL燒杯中;

      用20 mL石油醚將其溶解并移于250mL具塞錐形瓶中。

      加20 mL水和30 mL甲醇,振蕩30 min后,將全部液體移于分液漏斗中;

      待分層后,將下層溶液全部移到100 mL圓底燒瓶中,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至約5 mL,加水稀釋至約50mL,供凈化處理。

      3.4  供試品溶液的制備

      3.4.1 PriboFast® 黃曲霉毒素M1免疫親和柱的操作

      將免疫親和柱連接于50.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取50.0mL凈化溶液注入玻璃注射器;

      將空氣壓力泵與注射器連接,調(diào)節(jié)壓力使溶液以約2-3mL/min流速緩慢通過免疫親和柱,直至2~3mL空氣通過柱體;

      更換10ml注射器與親和柱連接,在注射器中加入10ml水,調(diào)節(jié)壓力使水以約6mL/min流速清洗親和柱。

      準(zhǔn)確加入4mL色譜級乙腈洗脫,流速為1 mL/min~2mL/min,收集全部洗脫液于玻璃試管中,供檢測用。(建議將乙腈的量分2-4次加入。每次加入后,要讓甲醇充分浸泡柱子里的凝膠2分鐘。洗脫后的乙腈溶液,建議水浴30℃加熱吹近干。用10%乙腈定容后上液相)

      3.5 測定

      精密量取1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液各20ul,注入液相色譜儀,測定峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。另精密量取供試品溶液20ul,注入液相色譜儀,測定峰面積,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品中相當(dāng)于黃曲霉毒素M1的量,計(jì)算,即得。

       

      1.本實(shí)驗(yàn)應(yīng)有相應(yīng)的安全、防護(hù)措施,并不得污染環(huán)境。

      2.殘留有黃曲霉毒素M1的廢液或廢渣的玻璃器皿,應(yīng)置于貯存容器(裝有10%氯酸鈉溶液)內(nèi),浸泡24小時以上,再用清水將玻璃器皿沖洗干凈。

       

       

       

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